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实时无标记动力学检测新技术

作者: 点击:308 发布时间:2022-03-11

现代生物学、医学及转化医学、药物学等研究中,随着功能基因组研究的深入,生物大小分子的生物学功能研究占据着非常重要的地位;生物大小分子的相互作用分析成为目前分子功能学研究中不可缺少的重要手段,因此一个好的分子互作研究工具,无疑将对我们的科研起到极大的促进作用。目前研究分子互作的检测技术层出不穷,从传统的终点法ELISA、Co-IP 、Western Blot杂交检测到近年迅速火热的实时无标记的分子互作系统无标记技术通常将蛋白质受体分子固定在传感器表面,然后注入配体(称为分析物)使其流过传感器。在特定的缔合时间后(由受体结合位点的饱和度决定),将不包含配体的溶液通过流通池注入以解离受体-配体复合物。受体和配体的结合和解离的变化将转化为光的干涉图案。这些变化基于与表面受体与配体分子结合的数量,并以传感图表示,从中可以计算出动力学缔合常数(kon)和解离常数(koff),以及Kd(图1

 


                             图1

相对其他只能做出终点检测的如Pull-down检测技术,无标记技术让研究者可以定量分析生物分子间的相互作用 Kon, Koff 和KD值,对分子间相互作用研究提供了更深入的分析。因此,无标记技术在生命科学研究中的作用越来越重要,且在很多医药及医学研究中颇受关注。那么今天推荐给大家的就是基于GCIGrating-Coupled Interferometry光栅耦合干涉)技术原理的一款设备WAVE delta,现在就带大家来了解这款性价比超高的黑马设备。




技术原理

与经典的SPR技术相比,GCI巧妙的利用波导技术的原理,将光路延伸至整个传感器表面如图2当配体(分析物)与固定在传感器表面的受体蛋白相互作用时,逝场会经历特征性的相位延迟将参考波和检测光波耦合到同一波导中干涉并产生信号[1],从而消除了由光学器件的热/机械位移引起的漂移,GCI技术极大地提高了检测信号的稳定性,每个渐逝波都探测到了表面的相互作用,该技术已经由Creoptix AG(瑞士)开发3SPR技术中的每个渐逝波通常覆盖约100 nm直径的表面积,而GCI中的渐逝波覆盖整个传感器表面约2 mm长度,从而探测出比SPR更多的相互作用[2]GCI仪器的高灵敏度使它们能够以低响应的解析动力学,从而使研究人员能够研究分子量比非常大(例如,数百个kDa固定的配体与200 Da的小分子分析物)分子之间的结合相互作用。可以测定低活性的配体和低密度的表面受体,与SPR Biocore仪器不同,由Creoptix AG设计的GCI在实际设备中既没有微流体通道也没有微阀。而是将微流体内置到一次性芯片中。这使得GCI能够检测粗样品(例如,细胞培养基,未纯化的细胞裂解物,脂质囊泡等),并通过光学生物传感器(可检测亲和力从低pM到数十mM)扩展动力学的测量范围。

 

  

技术特点

1.无与伦比的灵敏度

对于无标记技术,展现灵敏度的方式是看信号强度,而信号强度取决于配体和分析物的分子量比以及配体的固定水平。当配体和分析物的分子量比超过300时,无论如何提高配体固定水平,传统的无标记技术由于器原理的局限性都无法检测到分子间的相互作用,而GCI凭借其超高的灵敏度可以在不仅在分子量比大于300的正常固定水平下可以得到稳定的信号,且在配体低固定水平也能够准确表征其动力学信息。

 

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如图4,配体和分析物的分子量比为370,(图4左)配体固定水平为2775pg/mm2 (1pg/mm2=1RU),11结合的理论信号强度为7.5(理论值=1/分子量比*固定水平),实得信号值约为5.而传统的SPR技术无法表征分子量比超过300的动力学信息。这还不是GCI的极限,继续减少配体固定水平(图4右)到835RU,可以看到即使信号强度低于1RUGCI得到的信息依然准确,表现出GCI超高的灵敏度与强大的稳定性。

继续增加分子量比直至1000!(图5),GCI依然可以表征其动力学!

 


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2.超高时间分辨率

相比于传统的终点法ELISA、Co-IP 、Western Blot,无标记技术不仅可以检测KD,更重要的是可以给研究者提供动力学信息(结合和解离常数),而解离常数更是其重中之重。但对于一些(快上快下)的分子间动力学过程,其解离常数小于1s-1,现有的无标记技术很难准确表征,而GCI技术目前可以检测0.1s内分子间作用变化,表征解离速率小于10s-1的分子间相互作用。如图6

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3.创新性的芯片设计(维护成本极低)

   目前市场的主流的SPR品牌Biacore,光路系统相对复杂,维护成本比较高(单是流路管堵塞就需花费十几万元每年,而流路管道又特别细稍微粘稠样本就容易堵塞),仪器操作复杂且价格较高,需要专人保养。而Creoptix不仅创新性的提高的灵敏度和时间分辨率,且创新性的将微流路外置在芯片中,无需定期更换微流路,日常维护每年仅消耗100mLPBS,支持全血清,全血浆检测,无需担心堵塞!兼容4896384板任意组合,120h无人值守运行

 


4.更广泛的应用范围

得益于WAVE delta的灵敏度,时间分辨率和微流路外置的创新性提升,使科学家们可以做以前做不到的事情,看到以前到不到的信息。

 

7:固定膜蛋白(整个膜)的动力学表征




8VLPs的动力学表征(无需反转配体和样品)


9ADA定量(检测下限极低)

  

WAVE delta的应用范围和相关参数

分析领域 分子相互作用模式的研究;动力学常数的测定;亲和常数测定,浓度的测量及构象变化的速率等。 生命科学研究领域 蛋白质组学研究、癌症研究、新药研发、信号传递、分子识别、热力学分析、免疫调节、免疫测定、疫苗开发、瞬时结合、配体垂钓、结合特异性、结构与功能的关系及酶反应等。分析样品类型 :小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖到类脂、脂质体,噬菌体、病毒样颗粒和细胞等。

 

 

参数配置

流通池(通道)数量: 4

噪声(RMS)<0.01 pg/mm 1 pg/mm 2=1RU

漂移 <0.3 pg/mm 2 /min

读取频率 1 Hz, 10 Hz or 40 Hz

分子量:无限制

结合常数范围: ka = 10 3 —10 7 M -1 s -1

解离常数范围: kd = 10 -510 s -1

温控范围 WAVEdelta: 4°C - 45°C (max 20°C below ambient)   

微流路:整合到芯片中

脱气装置:内置

流速: 0—400ml/min

样品容量:两块48(96,384)孔板

自动化:120h无人值守运行

进样量:20-425uL(普遍100ul

缓冲液:自动转换 4 buffers

参考文献:

[1] Pedro J.S(2020)In vitro analytical approaches to study plant ligand-receptor interactions. American Society of Plant Biologists. 2:1687-1712

[2] Lukosz W (1991) Principles and sensitivities of integrated optical and surface plasmon sensors for direct affinity sensing and immunosensing. Biosens Bioelectron 6: 215–225


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